| 原題 | Re-Evaluating One-step Generation of Mice Carrying Conditional Alleles by CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing Technology |
|---|---|
| 掲載 | bioRxiv |
| 記述言語 | 英語 |
| 著者 | Channabasavaiah Gurumurthy, Rolen Quadros, John Adams, Pilar Alcaide, Shinya Ayabe, Johnathan Ballard, Surinder K. Batra, Marie-Claude Beauchamp, Kathleen A Becker, Guillaume Bernas, David Brough, Francisco Carrillo-Salinas, Ruby Dawson, Victoria DeMambro, Jinke D’Hont, Katharine Dibb, James D. Eudy, Lin Gan, Jing Gao, Amy Gonzales, Anyonya Guntur, Huiping Guo, Donald W. Harms, Anne Harrington, Kathryn E. Hentges, Neil Humphreys, Shiho Imai, Hideshi Ishii, Mizuho Iwama, Eric Jonasch, Michelle Karolak, Bernard Keavney, Nay-Chi Khin, Masamitsu Konno, Yuko Kotani, Yayoi Kunihiro, Imayavaramban Lakshmanan, Catherine Larochelle, Catherine B. Lawrence, Lin Li, Volkhard Lindner, Xian-De Liu, Gloria Lopez-Castejon, Andrew Loudon, Jenna Lowe, Loydie Jerome-Majeweska, Taiji Matsusaka, Hiromi Miura, Yoshiki Miyasaka, Benjamin Morpurgo, Katherine Motyl, Yo-ichi Nabeshima, Koji Nakade, Toshiaki Nakashiba, Kenichi Nakashima, Yuichi Obata, Sanae Ogiwara, Mariette Ouellet, Leif Oxburgh, Sandra Piltz, Ilka Pinz, Moorthy P. Ponnusamy, David Ray, Ronald J. Redder, Clifford J Rosen, Nikki Ross, Mark T. Ruhe, Larisa Ryzhova, Ane M. Salvador, Radislav Sedlacek, Karan Sharma, Chad Smith, Katrien Staes, Lora Starrs, Fumihiro Sugiyama, Satoru Takahashi, Tomohiro Tanaka, Andrew Trafford, Yoshihiro Uno, Leen Vanhoutte, Frederique Vanrockeghem, Brandon J. Willis, Christian S. Wright, Yuko Yamauchi, Xin Yi, Kazuto Yoshimi, Xuesong Zhang, Yu Zhang, Masato Ohtsuka, Satyabrata Das, Daniel J. Garry, Tino Hochepied, Paul Thomas, Jan Parker-Thornburg, Antony D Adamson, Atsushi Yoshiki, Jean-Francois Schmouth, Andrei Golovko, William R. Thompson, KC. Kent Lloyd, Joshua A. Wood, Mitra Cowan, Tomoji Mashimo, Seiya Mizuno, Hao Zhu, Petr Kasparek, Lucy Liaw, Joseph M. Miano, Gaetan Burgio |
| DOI |
概要
CRISPR-Cas9による遺伝子編集技術は、マウスのノックアウトアレルの作製を大きく容易にし、従来のマウス胚性幹細胞技術の手間と時間のかかる工程の多くを不要にしました。しかし、条件付きノックアウトアレルの作製は依然として大きな課題です。以前の研究では、2本のシングルガイドRNA（sgRNA）と2本の一本鎖オリゴヌクレオチド（ssODN）を用いる方法（2sgRNA-2ssODN法）で、マウスの条件付きノックアウトアレルを最大16%の効率で作製できたと報告されていました。
私たちは、世界各地の17のトランスジェニック・コア施設・研究室・プログラムからなるコンソーシアムで得た大規模なデータセットをもとに、この方法を再評価しました。データセットは、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションを行った17,887個の受精卵と1,718匹の出生マウスからなり、そのうち2つのLoxPがシス配置で正しく挿入されていたのはわずか15匹（0.87%）で、この方法の効率が非常に低いことが示されました。
2sgRNA-2ssODN法で条件付きアレルを作製するのに必要な要因を明らかにするため、一般化線形回帰モデルによる解析を行ったところ、sgRNAやCas9タンパク質の濃度、LoxPの挿入位置の距離といった要因は、この手法の成功を予測するものではありませんでした。成功を左右する主な要因は、2つのsgRNA切断部位のあいだのDNA断片を失うことなく、近位と遠位のLoxP配列を同時に完全な形で挿入できる確率でした。
大規模データの解析から、2sgRNA-2ssODN法では望ましくないアレルが大量に（99%超）生じ、望ましいアレルはごくわずか（1%未満）で、平均して1,192個の受精卵が必要になることが示されました。
